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Fura-2,五銨鹽1mg說明書

Fura-2,五銨鹽1mg說明書

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Fura-2,五銨鹽1mg說明書是一種在較高溫度下保存 RNA 樣品的非凍型無毒溶液,它能 迅速滲入細胞內,通過高效抑製 RNase 的活性而保存 RNA 的完整性。

Fura-2,五銨鹽1mg說明書 詳細資料

注意事項:
Fura-2,五銨鹽1mg說明書● 溶液PE *次使用前請按瓶上標簽加入4 倍體積的無水乙醇,即15 ml 溶液PE 中加入60 ml 無水乙醇,20 ml 溶液PE 中加入80 ml 無水乙醇,使用後立即蓋緊蓋子。
● 本產品對電泳使用的Agarose 種類沒有嚴格限製,可以使用普通Agarose 。為了保證回收DNA 的質量和DNA 回收效率,希望使用高純度的Agarose ,但沒有必要一定要使用低熔點的Agarose 等。
● 電泳時請使用新鮮配製的TAE 電泳緩衝液,以免影響電泳及回收效果。
● 請適當延長電泳時間,在條帶分離清晰後進行切膠回收,以免回收到多餘雜帶。
● 為提高DNA 回收收率,切膠時應盡量除去多餘的膠塊。
● 本試劑盒純化柱的DNA 吸附能力強。但如果DNA 濃度小,或DNA 初始量少,回收率將會偏低。
● 溶液Eluent(10 mM Tris-HCl, pH 8.5)中不含EDTA,其收集的DNA 片段可直接用於各種酶促反應等,不會影響後續試驗。
● 為了保證回收效率,請不要使用未調整pH 值的超純水洗脫目的片段。

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Fura-2,五銨鹽1mg說明書

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● 請嚴格按照操作步驟操作。

問:常用的DNA 濃度及純度檢測方法有哪些?
Fura-2,五銨鹽1mg說明書答:回收得到的DNA 片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。瓊脂糖凝膠電泳通過對比定量的Marker 來定量濃度;紫外分光檢測OD260/280 比值,OD260/280 比值在1.7-1.9 之間說明所得  DNA  純度較好,如果洗脫時不使用溶液Eluent而使用去離子水,比值會偏低,因為pH 值和離子存在會影響光吸收值,但不表示純度低。

問:長片段回收時應注意哪些問題?
答:Fura-2,五銨鹽1mg說明書當DNA 片段長度較長(5   kb 以上)時,回收效率會有所下降,這是DNA 切膠回收時的常見現象。此時建議按以下方法解決問題:
    1 適當增加待回收DNA 樣品的點樣量;
    2 由於長片段DNA 不易從樹脂上洗脫下來,建議洗脫兩次,可以提高洗脫效率;
    3 減少操作過程中對長片段DNA 的物理損傷,如混合振蕩操作不要過於劇烈,切膠時不要將DNA 長時間暴露在紫外等下。

操作步驟:
1  Fura-2,五銨鹽1mg說明書切取含有目的DNA 片段的瓊脂糖凝膠條帶。
   ● 盡量切除不含有目的DNA 部分的凝膠,減少凝膠體積,提高DNA 回收率。
   ● 切膠時,請使用長波長UV  (360 nm )光盒。且不要將DNA 長時間暴露在紫外燈下,以防DNA 損傷。
2  稱取凝膠的重量近似地確定其體積。
   ● 凝膠重量的稱量方法:取1.5 ml 離心管電子天平稱初質量,切膠裝在離心管後稱終質量,兩者差即為膠的質量。不同廠家離心管的重量可能有差異,因此,每個離心管的重量需單獨稱量。
3  按照每100 mg 瓊脂糖凝膠對應100 µl 溶液BD 的比例,向離心管中加入溶液BD。
4  50 ℃水浴7-10min,直至凝膠完全溶化。期間需要振蕩混合3 次。
   ● 瓊脂糖必須完全融化,以免堵塞柱子,嚴重影響DNA 段的回收效率。
   ● 如果總體積大於500 µl,可適當增加溶膠時間。
   ● 若此時溶液變紅,可加10 µl 3M NaAC  (pH 5.2)。
5  將步驟4 所獲溶液置於DNA 純化柱中,靜置2min 。
   ● 膠塊完全溶解後將膠溶液溫度降至室溫再上柱,因為純化柱在較高溫度時結合DNA  的能力較弱。
6  12,000 rpm 離心1min。若溶液量大於DNA 純化柱的容積,可分兩次離心,棄濾液。
   ● 此時DNA 被吸附於DNA 純化柱中的矽膠膜上。
7  加入500 µl 溶液BD。12,000 rpm,  離心1min,棄濾液
8  加入500 µl 溶液PE。12,000 rpm,  離心1min,棄濾液。
   ● 溶液PE 初次使用前用無水乙醇按1: 4 稀釋,即含80% 乙醇。
   ● 此步驟的作用是將矽膠膜上吸附的蛋白、鹽等雜質洗脫,以獲得高質量DNA 段。
9  加入500 µl 溶液PE。12,000 rpm,  離心1min,棄濾液。
10 12,000 rpm 離心  3min ,以徹底去除純化柱中的液體。
   ● 此步驟的作用是去除殘留乙醇,避免殘留乙醇影響後續酶促反應。同時也利於DNA 段的充分溶解。
11  將離心柱置於新的1.5 ml 離心管中。向純化柱的中央處,懸空滴加30-100 µl 溶液Eluent  (60℃預熱),靜置2min 。12,000 rpm  離心1min,管底即為目的DNA 段。貯存於-20℃。
   ● 溶液Eluent 可用無菌雙蒸水代替,但其pH 需為8.0-8.5,加入體積視DNA 目的段的多少、用戶對目的濃度要求而定。
   ● 對溶液Eluent 60℃預熱,會提高提取DNA 目的段的產量。

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